Выделение белков

Выделение чистого белка (иногда применяют не совсем удачный термин «белок гомогенный») — необходимая причина изучения его функциональных свойств и строения.

Получение белков в чистом химическом виде включает удаление небелковых примесей и разделение белковых компонентов между собой. Последняя часть задания особенно сложна, соответственно, ее решение определяет выбор схем выделения белка. Необходимо учитывать определенные особенности поведения, характерные всем белкам.

В первую очередь, это способность белков к денатурации — возможность претерпевать изменения пространственного строения, способные приводит к частичной или полной потере функциональных свойств. Денатурация во ряде случаев обратима, но эта обратимость не осуществляется автоматически, она требует в каждом случае подбор специальных приемов. Одновременно с этим, полностью или даже частично денатурированные белки достаточно уязвимы к необратимым повреждениям, особенно для воздействия протеолитических ферментов, поэтому следует избегать условий, способствующих денатурации.

Для избежания тепловой денатурации, белок выделяют при низкой температуре — не выше 4 єС. Необходимо избегать пороговых значений pH. При низких рН белки легко денатурируют из-за протонирования заряженных отрицательно карбоксильных групп в нормальных условиях, и возникающего после этого резкого увеличения положительных зарядов, благоприятно действующего развертыванию компактной структуры. При рH 10 в щелочной среде утрачиваются положительные заряды, которые обусловлены протонированием лизина, и вновь наступает декомпенсация поверхностных зарядов, которая дестабилизирует глобулу. В то же время фенольные гидроксилы остатков тирозина, скрытые внутри глобулы, при получении отрицательных зарядов, стремятся к выходу на поверхность – это способствует денатурации белка.

В растворах с большим содержанием щелочи происходят реакции, ведущие к повреждению белка. Происходит отщепление серы от имеющихся цистеина и цистина, отщепление цепей полисахаридов, присоединенных к серину в гликопротеинах. Образующиеся остатки непредельной аминокислоты присоединяются к ближайшим -аминогруппам лизина, и образуют лизиноаланин — соединения, чье присутствие в кислотном гидролизате белка говорит о глубоком повреждении структуры самого белка.

Причиной денатурации может быть применение органических растворителей, способных нарушать систему гидрофобных контактов, существенную для стабильности белка. Нужно учитывать возможную денатурацию белка на границе разделения фаз, особенно при образовании пены. Во время выделения очень малого количества белка следует учитывать потери, вызываемые его адсорбцией на поверхности стекла или полимерного материала, достаточно часто необратимой, и достаточно значительной на заключительной стадии очистки.

При выделении белков особую опасность представляют протеолитические ферменты, содержащиеся в исходных материалах, даже если они есть в следовых количествах. Повреждения, которые приводят к образованию ложной множественной формы белка, в отдельных случаях — его глубокое расщепление, бывают особенно вероятными при схеме выделения, включающей условия, способствующие приближению белка к денатурации.

Для исключения или предотвращения протеолиза необходимо на первичных стадиях очистки применять операции для отделение протеиназ, добавлять к смеси ингибиторы разных классов протеиназ. Здесь важно очень быстро проводить очистку белка — это уменьшает опасность протеолиза и возможность денатурации.

Существует предположение о специфической нестабильности чистых белков. Реально, содержащиеся посторонние белки в неочищенных препаратах в некоторой мере защищают белок от протеолиза и денатурирующих воздействий. На промежуточных стадиях — при неполной очистке — опасность протеолиза увеличивается. Когда достигается удаление следов протеиназ на финишных этапах очистки, вновь должна возрасти стабильность белка. Но, при этом возрастает и риск сорбционных потерь на поверхности, которая могжет восприниматься экспериментатором как нестабильность, присущая чистому белку.

Статья написана при поддержка магазина автозапчастей.